Computergestützte selbstkorrigierte quantitative 3D-topografische Bildgebung

Computergestützte selbstkorrigierte quantitative 3D-topografische Bildgebung Publikation
L. Zhukova ¹, R. Artigas ¹, G. Carles
¹ Sensofar-Tech, S.L. (Spanien)
Scientific Reports Band 15, Artikelnummer: 24298 (2025)

Zusammenfassung

Die dreidimensionale Mikroskopie ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Inspektion von Proben in einem breiten Spektrum von Anwendungsfeldern geworden – von der wissenschaftlichen Forschung bis hin zu industriellen Anwendungen. In vielen Fällen sind präzise geometrische Messungen an 3D-Formen und -Strukturen im Mikromaßstab von entscheidender Bedeutung. Dafür basieren etablierte Techniken in der Regel auf axialem Scannen, um das gemessene Volumen abzutasten. Eine unvollkommene Bewegung des Scanners führt jedoch zwangsläufig zu Fehlern in den Messergebnissen. Wir präsentieren eine Methode zur Abschätzung und Unterdrückung von Positionierungsfehlern des Scanners durch computergestützte Analyse der erfassten Daten, was zu einer verbesserten Messpräzision führt. Während Methoden zur Korrektur solcher Fehler dank der Fransenanalyse für interferometrische Systeme verfügbar und gut bekannt sind, blieb dies für nicht-interferometrische Technologien wie die konfokale Mikroskopie bislang eine ungelöste Herausforderung. Wir demonstrieren die Methode experimentell und berichten über eine Verzehnfachung der axialen Präzision konfokaler Mikroskopiesysteme mit motorisierten Scannern. Die Ergebnisse sind vergleichbar mit oder übertreffen sogar diejenigen hochwertiger piezoelektrischer Scanner, während gleichzeitig die großen Messbereiche motorisierter Linearachsen erhalten bleiben. Darüber hinaus bietet diese Methode eine kosteneffiziente Alternative zu hochwertigen Scannern, indem sie kostengünstige Rechenleistung anstelle teurer Hardware nutzt, und sie lässt sich mit minimalen Modifikationen nahtlos in bestehende Systeme integrieren.

1. Einleitung

Die dreidimensionale optische Mikroskopie bildet die Grundlage für unsere Fähigkeit, Strukturen im Mikro- und Nanomaßstab nichtinvasiv zu beobachten und zu messen[1,2,3,4,5]. Von der Untersuchung der Wechselwirkungen dreidimensionaler Strukturen in den Lebenswissenschaften[6,7,8,9] bis zur Überwachung hochpräziser Fertigungsprozesse[10,11,12,13,14] ist dreidimensionale Bildgebung schlicht unverzichtbar. Jede Form der Bildgebung ist jedoch ein zweidimensionaler Prozess, und es sind Strategien erforderlich, um dreidimensionale Informationen aus den erfassten Daten präzise zu rekonstruieren. Der einfachste und gebräuchlichste Ansatz besteht darin, das Probenvolumen Ebene für Ebene zu scannen, da kamerabasierte Bildgebungssysteme jeweils eine Ebene erfassen und Punkt-Scansysteme typischerweise ein schnelles zeilenweises Raster-Scanning innerhalb einer Ebene durchführen. Diese Strategie ist insbesondere für die hochauflösende Mikroskopie äußerst zweckmäßig, da aufgrund der geringen Schärfentiefe bei der erforderlichen hohen numerischen Apertur (NA) jeweils nur eine dünne Ebene im Fokus liegt. Letztlich ist Scannen praktisch immer erforderlich, um dreidimensionale Proben zu messen.

In vielen Wissenschaftsbereichen ist die Bildgebung nur der Ausgangspunkt für quantitative Messungen, und die 3D-Mikroskopie bildet dabei keine Ausnahme. Für einige Anwendungen kann die genaue Lokalisierung von 3D-Strukturen oder Referenzmarkern entscheidend sein. Dies kulminiert im Bereich der optischen Messtechnik, in dem hochpräzise Messung ihr raison d’être[11] ist. Folglich ist eine genaue Positionierung während des axialen Scans für jede quantitative Bildgebung von zentraler Bedeutung – insbesondere für die mikroskopische dimensionale Messtechnik.

Aufgrund dieser hohen Relevanz richten wir unsere Aufmerksamkeit auf die hochpräzise 3D-topografische Bildgebung bzw. optische Profilometrie, bei der Scannen zur Gewinnung räumlicher Messdaten eingesetzt wird. Optische Profiler spielen in verschiedenen Branchen wie der Mikroelektronik, der biomedizinischen Technik und der Halbleiterindustrie eine entscheidende Rolle, da sie detaillierte Oberflächenmessungen ermöglichen. Das Funktionsprinzip besteht darin, einen Bereich abzubilden und während eines axialen Scans einen Bildstapel zu erfassen. Die Lokalisierung des Punktes der besten Fokussierung an jedem Bildpixel liefert eine Höhenkarte bzw. Topografie der Probe. Allgemein wird ein fokussensitives Signal entlang des axialen Scans abgetastet, wodurch die sogenannte axiale Antwort berechnet wird; die präzise Lokalisierung ihres Maximums liefert die Höhe der abgebildeten Probe[15]. Methoden zur Berechnung eines solchen Signals bilden die Grundlage etablierter und ausgereifter Technologien, darunter konfokale Mikroskopie[16], Fokusvariation[17] und Interferometrie[18,19].

In jedem Szenario, in dem Scannen verwendet wird, um eine räumliche Messdimension zu erweitern, werden Fehler durch eine unvollkommene Bewegung des Scanmechanismus direkt auf die endgültige 3D-Messung übertragen. Daher ist die Reduzierung oder Korrektur dieser Fehler von größter Bedeutung. Interessanterweise ist dies in der Interferometrie auf natürliche Weise möglich, da die Analyse der Phasenlage der Interferenzstreifen während des Scans eine hochpräzise Überwachung der pseudo-zufälligen Scannerbewegung ermöglicht[20]. Obwohl dies in diesem Bereich gut bekannt ist, ist es nur für interferometrische Systeme möglich, sodass das Problem unvollkommener Scannerbewegungen für wichtige Techniken wie die konfokale Mikroskopie oder die Fokusvariation ungelöst bleibt.

In dieser Arbeit schlagen wir eine computergestützte Methode vor, die diese Lücke schließt und eine Lösung bietet, um die Genauigkeit und Präzision scangestützter nicht-interferometrischer 3D-topografischer Bildgebungssysteme zu erhöhen. Die Methode ist rein rechnerisch und insofern selbstkorrigierend, als sie nur die Verarbeitung der Scandaten erfordert, ohne zusätzliche Hardwarekomponenten. Hier stellen wir das Konzept vor und demonstrieren eine Verbesserung der Präzision von Messungen, die mit motorisierten Linearscannern in einem konfokalen optischen Profiler durchgeführt werden, um eine Größenordnung. Eine solche Verbesserung war bislang nicht möglich und konnte nur durch den Einsatz hochkomplexer und teurer Scanner, hauptsächlich auf Basis piezoelektrischer Wandler, umgangen werden. Unsere Methode ermöglicht beispielsweise den Einsatz motorisierter Linearachsen mit ihrem vorteilhaft großen Scanbereich bei einer Präzision, die der piezoelektrischer Systeme entspricht.

2. Ergebnisse

2.1. Problemstellung

Der Messprozess eines optischen Profilers umfasst typischerweise einen axialen Scan, um die Höhe der Probe an jedem Bildpixel zu lokalisieren. Für einen solchen Scan würde ein idealer Scanner die vorgegebene Bewegung fehlerfrei ausführen. Das heißt, die tatsächliche Position der Bewegung stimmt mit der vorgegebenen (gewünschten) Position überein. Eine lineare Beziehung zwischen vorgegebener und ausgeführter Position ist akzeptabel, da sie keine Messfehler einführt, solange der Verstärkungsfaktor gemessen und kalibriert werden kann. Ein realer Scanner weist jedoch pseudozufällige Abweichungen von der Linearität auf, die – wenn sie nicht berücksichtigt werden – direkt als Fehler in die endgültige 3D-Messung eingehen. Diese werden als Nichtlinearitätsfehler des Scanners bezeichnet und stellen neben weiteren wichtigen Einflussgrößen wie optischen Aberrationen, mechanischem Drift, Vibrationen und Rauschen eine relevante Quelle verminderter Präzision in der quantitativen 3D-Mikroskopie dar. Solche Abweichungen liegen der nichtlinearen Form der sogenannten Antwortkurve des Systems zugrunde[21,22], also einer Funktion, die die gemessene Position mit der tatsächlichen Position in Beziehung setzt. Eine Antwortkurve mit stark übertriebenen Nichtlinearitätsfehlern ist in Abb. 1 (a) dargestellt. Topografische Messungen werden typischerweise erhalten, indem die axiale Antwort über den Scanbereich berechnet wird, um den besten Fokus für jedes Pixel zu finden. Nichtlinearitätsfehler verschieben daher das Maximum und führen zu falschen Höhenwerten, wie in Abb. 1 (b) veranschaulicht.

Aus diesem Grund wurde großer Aufwand betrieben, die Antwort von Scannern in hochpräzisen Systemen zu linearisieren. Dazu zählen der Einsatz piezoelektrischer Systeme mit kapazitiven Sensoren zur Rückkopplungsregelung oder hochwertige optische Encoder. Piezoelektrische Systeme bieten jedoch neben ihrem hohen Preis nur einen begrenzten Messbereich von wenigen hundert Mikrometern, was für Allzweckinstrumente wenig ideal ist. Motorisierte Linearachsen-Scanner hingegen bieten große Messbereiche, die für jede Anwendung geeignet sind, zeigen jedoch stärkere Nichtlinearitätsfehler. Diese können auf eine Kombination aus inhärenten mechanischen Unvollkommenheiten von Zahnrädern, Aktoren und Führungen sowie auf eine variierende Reaktion des Scanners auf Eingangssignale infolge von Spiel, Reibung oder Hysterese des Motorregelsystems zurückgeführt werden. Eine alternative Möglichkeit zur Korrektur von Nichtlinearitätsfehlern besteht darin, während jedes Messscans einen unabhängigen Mechanismus zur Erfassung der tatsächlichen Scannerbewegung einzusetzen und diese in der rekonstruierten Messung zu berücksichtigen; dies ist jedoch häufig nicht möglich.

Zur Formulierung des Problems sei z=Φ(x,y) die Höhenkarte der Probe in einem Bereich des Sichtfeldes, also unsere Messgröße, und ξ(z) die Antwortkurve des Systems, wobei (x, y, z) die räumlichen Koordinaten im Probenvolumen sind. Wir können den Messprozess modellieren als,

wobei ϵ(x,y) zufälliges Messrauschen ist und der erste Term die Funktion ξ ist, ausgewertet an der axialen Position Φ. Da ξ unbekannt ist, sind Fehler in die Messung eingebettet, und es gibt keine eindeutige Möglichkeit, ξ von der Form der Probenoberfläche Φ zu trennen. Mit anderen Worten: Allein aus der Messung ist es unmöglich, zwischen den tatsächlichen Merkmalen der Probe und den durch eine unvollkommene Scannerbewegung eingeführten Fehlern zu unterscheiden.

Natürlich wäre dies kein Problem, wenn ξ(z) gemessen und als Kalibrierung gespeichert werden könnte. Die Quellen der Nichtlinearität sind jedoch pseudozufällig und können sich bei wiederholten Messungen unterscheiden (siehe Supplementary Abb. 1). In der Praxis bedeutet dies, dass eine vorherige Kalibrierung nicht möglich ist. Glücklicherweise sind Nichtlinearitätsfehler bei hochpräzisen Komponenten typischerweise sehr klein im Vergleich zum angebotenen Messbereich, und in der Praxis kann angenommen werden, dass die entsprechende Antwortkurve einer monotonen Funktion mit glatten und amplitudenarmen Abweichungen von der Linearität folgt.

Ziel der hier vorgestellten Methode ist es, die Antwortkurve ξ(z) durch eine computergestützte Analyse der Messscandaten zu bestimmen. Gelingt dies, können Nichtlinearitätsfehler korrigiert und die Präzision der Messungen deutlich erhöht werden.

2.2. Funktionsprinzip der computergestützten Selbstkorrektur

Das Wesen der Methode besteht darin, eine zweite Topografie der Probe, Φ′_meas (x,y), mit einem relativen vertikalen Offset zu messen, die jedoch aus Daten berechnet wird, die während desselben mechanischen Scans erfasst wurden. Dadurch ist sichergestellt, dass die Antwortkurve ξ(z) für beide Topografien identisch ist. Berechnet man eine zweite Messung mit einem vertikalen Offset Δz, so gilt,

die ebenfalls von Nichtlinearitätsfehlern beeinflusst wird. Diese Fehler unterscheiden sich jedoch von denen, die die erste Topografie in Gl. 1 beeinflussen, aufgrund der eingeführten vertikalen Verschiebung. Unter der Annahme, dass die Antwortkurve ξ(z) unbekannt, aber deterministisch ist, können wir diese differentiellen Messungen verwenden, um eine Schätzung ihrer Ableitung zu berechnen als,

wobei ΔΦ_meas(z) die Differenz zwischen den Topografien ist, ausgedrückt als Funktion von z.

Beachten Sie, dass bei einem Scan ohne Nichtlinearitätsfehler beide Topografien bis auf die konstante Differenz über das Sichtfeld identisch wären. Folglich ergäbe ihre Subtraktion einen konstanten Wert. Wenn der Scan jedoch erhebliche Nichtlinearitätsfehler enthält, wird jede berechnete Topografie aufgrund des vertikalen Offsets von unterschiedlichen Bereichen der Antwortkurve beeinflusst. In diesem Fall ist die Differenz zwischen den Topografien nicht mehr konstant, sondern wird zu einer deterministischen Funktion der Antwortkurve ξ(z). Da die Antwortkurve außerdem nicht von (x, y) abhängt – sie ist eine Eigenschaft des Scanners –, führen Nichtlinearitätsfehler zu einer Variation der Differenz Φ′_meas(x, y) – Φ_meas(x, y), die nur von der Höhe der Probe abhängt, was wir in Gl. 3 mit ΔΦ_meas(z) bezeichnen.

Die Annahme, dass ξ nicht von (x, y) abhängt, gilt, wenn das mechanische Verhalten des Scansystems hinreichend robust ist, um eine geradlinige Bewegung während des Scans sicherzustellen, was mit Standard-Präzisionskomponenten in gängigen Scannern leicht erreichbar ist.

Ziel der Methode ist es, diese Information zu nutzen, um die Antwortkurve des Systems abzuschätzen. Dies erreichen wir, indem wir numerisch die geschätzte Antwortkurve so bestimmen, dass – wenn sie zur Korrektur der Nichtlinearitätsfehler auf beide Topografien angewendet wird, d. h. durch Invertierung von Gl. 1 und 2 – ihre Subtraktion tatsächlich den erwarteten konstanten vertikalen Offset ergibt.

Prinzipiell liefert die numerische Integration von Gl. 3 direkt die Antwortkurve der Messung, ξ(z). Ist sie bekannt, kann sie verwendet werden, um Gl. 1 oder Gl. 2 zu invertieren und nach Φ(x,y) aufzulösen. Da dieser Ansatz versucht, die Nichtlinearitätsfehler aus den Topografien zu korrigieren, indem eine Antwortkurve verwendet wird, die aus den unkorrigierten Topografien geschätzt wird, bezeichnen wir dies als computergestützte Selbstkorrektur.

Die numerische Berechnung der Größe ΔΦ_meas(z) aus der Menge verrauschter und über (x, y) verteilter pixelierter Messpunkte ist jedoch nicht trivial. Um jedem Differenzwert den entsprechenden z-Wert zuzuordnen, wäre eigentlich die Kenntnis von ξ(z) erforderlich. Mit anderen Worten: Eine direkte Messung von ΔΦ_meas aus den beiden Messungen ergibt ΔΦ_meas(ξ(z)), da ξ(z) gemäß Gl. 1 unsere naive Beobachtung der Höhe z ist. Da ξ(z) anfangs unbekannt ist, bleiben somit Restfehler bestehen. Glücklicherweise lässt sich der Prozess bis zur Konvergenz iterieren: Wir können ΔΦ_meas berechnen, Gl. 3 integrieren, um eine Schätzung von ξ(z) zu erhalten, diese zur Korrektur der Nichtlinearitätsfehler verwenden, dann erneut ΔΦ_meas berechnen usw. Einzelheiten hierzu finden sich unter Methoden.

Eine Veranschaulichung des Prozesses ist in Abb. 2 dargestellt. In diesem Beispiel verwenden wir die simulierte Antwortkurve (mit stark übertriebenen Nichtlinearitätsfehlern zur besseren Veranschaulichung) aus Abb. 1 (a). Beachten Sie, dass die Kurve im Voraus unbekannt ist und ihre Schätzung das Ziel unserer Methode darstellt. Wir simulieren eine Beispieltopografie definiert durch Φ(x) = 0.2x, wobei wir der Übersichtlichkeit halber die Abhängigkeit von y weglassen, ohne die Allgemeinheit einzuschränken. Führt man eine rauschfreie Messung mit einem System durch, das der Antwortkurve unterliegt, erhält man die gemessene Topografie Φ_meas(x), die in Abb. 2 (a) blau dargestellt ist. Die Messung der vertikal verschobenen Topografie Φ′_meas(x) ist ebenfalls in (a) orange dargestellt, mit Δz=10μm. Es ist gut zu erkennen, wie die Nichtlinearitätsfehler Unterschiede zwischen den Messungen erzeugen, die in verschiedenen axialen Bereichen größer oder kleiner als Δz sind: Beispielsweise ist ΔΦ_meas im Bereich z=38μm (d. h. x=190μm) größer und im Bereich z=70μm (d. h. x=350μm) kleiner. Diese Variation ist in (b) für dieses illustrative Beispiel dargestellt, aufgetragen als Funktion von z (blau) und auch als Funktion von ξ(z) (rot). Beachten Sie, dass wir zunächst Letzteres erhalten, obwohl uns Ersteres interessiert. Wenn wir dies zur Schätzung von ξ(z) verwenden, bleiben einige Fehler bestehen; wenn wir es jedoch zur Korrektur der Messung Φ_meas(x) anwenden, erhalten wir eine verbesserte Schätzung der tatsächlichen Höhenkarte Φ. Mit der Verbesserung dieser Schätzung verbessert sich auch die Schätzung von ξ(z). Daher konvergiert der Prozess bei Iteration zu ξ(z) und Φ(x).

In den nächsten Unterabschnitten stellen wir eine Metrik vor, um die Schwere von Nichtlinearitätsfehlern experimentell zu quantifizieren. Anschließend schlagen wir drei verschiedene Methoden vor, um das Topografiepaar während eines einzelnen Scans der motorisierten Linearachse zu erfassen. Erstens verwenden wir einen replizierten Detektionsmechanismus mit unabhängigen Kameras, die mit differenziellem Fokus eingestellt sind. Zweitens berechnen wir die beiden verschobenen Topografien durch Differenzierung der axialen Antwort des Instruments und Lokalisierung der beiden Wendepunkte auf beiden Seiten des Maximums. Und schließlich nutzen wir die intrinsische longitudinale chromatische Aberration des Bildgebungssystems, um mit LED-Beleuchtung unterschiedlicher Wellenlängen zwei Topografien zu berechnen. Wichtig ist, dass die beiden letztgenannten Ansätze die Implementierung der Methode in bestehende Produkte ohne Hardwaremodifikation ermöglichen.

2.3. Leistungsbewertung

Zur experimentellen Bewertung der Leistungsfähigkeit der Methode schlagen wir vor, die 3D-topografische Oberfläche eines zertifizierten Stufenhöhenstandards zu messen und eine Metrik basierend auf der gemessenen Stufenhöhe aus einer Reihe von Profilen senkrecht zur Stufe zu berechnen, wie in Abb. 3 dargestellt. Da die Messung der Stufenhöhe von Nichtlinearitätsfehlern des Scanners beeinflusst wird, fällt sie tendenziell höher oder niedriger als der wahre Wert aus, abhängig von der Steigung der Antwortkurve zwischen den beiden Höhenpunkten. Interessanterweise stellt man sicher, dass jedes Profil von einem anderen Bereich der Antwortkurve beeinflusst wird und somit der gesamte axiale Bereich effektiv abgetastet wird, wenn man den Standard in Richtung der Stufe verkippt, sodass die verschiedenen Profile zu zunehmend höheren Positionen versetzt sind. In diesem Fall erhöhen Nichtlinearitätsfehler die Stufenhöhenmessung für einige Profile und verringern sie für andere. Daher nimmt die Streuung der Messungen über die Profile hinweg mit der Schwere der Nichtlinearitätsfehler zu. Als Erfolgsmetrik für die Unterdrückung von Nichtlinearitätsfehlern berechnen wir daher die Standardabweichung der für alle Profile gemessenen Stufenhöhenwerte,

wobei und die oberen und unteren gemessenen Höhen der Stufe im Profil i sind und und ihre Mittelwerte über alle N Profile darstellen, siehe Abb. 3.

2.4. Implementierung mittels replizierter Detektion

Um die vorgeschlagene Selbstkorrekturmethode experimentell zu demonstrieren, haben wir einen Mikroskopaufbau mit repliziertem Bildpfad realisiert, wie in Abb. 4 dargestellt. Ein axiales Scansystem auf Basis einer motorisierten Linearachse wird verwendet, um die Probe relativ zum System zu scannen. Das System implementiert aktive Beleuchtungsfokusvariation[23], wobei strukturierte Beleuchtung über eine transmissive Maske mit Schachbrettmuster durch eine Tubuslinse auf die Probe projiziert wird. Um die axiale Antwort für jedes Pixel zu erhalten, berechnen wir ein Maß für den lokalen Kontrast des Schachbrettmusters während des Scans (weitere Informationen finden sich unter Methoden). Die Lokalisierung des Maximums dieser axialen Antwort liefert für jedes Pixel einen Höhenwert und damit eine Topografie der Probe. Ein Foto des optischen Aufbaus ist in Supplementary Abb. 2 und Details zur Kalibrierung in Supplementary Abb. 3 zu finden.

Ein Strahlteiler wird verwendet, um die Detektion mittels zweier Kameras zu replizieren, die relativ zueinander mit einem axialen Offset angeordnet sind, ansonsten jedoch identische Bildpfade besitzen. Auf diese Weise sind während eines einzelnen Scans der Probe die von jeder Kamera erfassten axialen Antworten annähernd identisch, jedoch entsprechend verschoben. Die Nichtlinearitätsfehler des Scanners sind jedoch für beide identisch. Somit erhalten wir ein Topografiepaar, das die Bedingungen zur Anwendung der vorgeschlagenen Selbstkorrekturmethode erfüllt.

Wir haben einen geneigten Spiegel abgebildet, für jede Kamera eine Topografie rekonstruiert und die Selbstkorrektur angewendet, um Nichtlinearitätsfehler zu unterdrücken (weitere Informationen finden sich unter Methoden). Die Differenz zwischen diesen Topografien ist in Abb. 5 (a) dargestellt, wobei die Welligkeit ein Hinweis auf Nichtlinearitätsfehler ist, während Abb. 5 (b) zeigt, wie diese Welligkeit durch die Korrektur unterdrückt wird.

Zur Quantifizierung der Unterdrückung haben wir einen Stufenhöhenstandard gemessen, um die in Gl. 4 definierte Metrik σSH zu berechnen. Die Selbstkorrekturmethode führte zu einer Reduktion um mehr als den Faktor 6, wie in Abb. 6 gezeigt, die ein Histogramm der Stufenhöhenmessung vor und nach der computergestützten Selbstkorrektur enthält. Dies weist auf eine starke Unterdrückung der Nichtlinearitätsfehler und damit auf eine verbesserte Messpräzision hin. Die gemessene Probe ist ein Stufenhöhenstandard mit einer zertifizierten Höhe von 7.62μm und einer zertifizierten Unsicherheit von 0.06μm. Die Ergebnisse zeigen eine erhöhte Präzision, jedoch verändert oder verbessert die Selbstkorrektur nicht die Genauigkeit des Instruments, die allgemein durch Einbeziehung eines Verstärkungsfaktors kalibriert wird, der die Antwortkurve skaliert. Da wir uns nur auf deren Linearisierung konzentrieren, ist die für die Bewertung gewählte relevante Metrik die Streuung über die Messungen.

In diesem Fall haben wir absichtlich Nichtlinearitätsfehler im Scan-Treiber erzeugt, um die Korrektur besser sichtbar zu machen; siehe Supplementary Note 3 und Supplementary Abb. 4 für Einzelheiten. Im nächsten Unterabschnitt demonstrieren wir die Methode an einem kompakten Tischsystem.

2.5. Implementierung auf Instrumenten der neuesten Generation

Für eine praxisnähere Anwendung haben wir die Methode auch auf einem kommerziellen konfokalen optischen Profiler (S neox, Sensofar) mit motorisierter Linearachse implementiert. Die Experimente wurden mit einem Mikroskopobjektiv 20X/0.45 NA durchgeführt. In diesem Fall ist eine replizierte Detektion mit zwei Kameras nicht möglich, daher schlagen wir zwei alternative Mechanismen vor, um das für die Selbstkorrektur erforderliche Topografiepaar aus einem einzigen Scan und mit nur einer Kamera zu erfassen. Die verwendeten Messparameter entsprechen der Standardkonfiguration des Systems.

Differenzierung der axialen Antwort

Im Allgemeinen wird die Höhe an jedem Pixel einer Messung mit einem optischen Profiler typischerweise durch Anpassung einer Kurve an einige Abtastpunkte um die Position des Maximums der axialen Antwort bestimmt. Hier schlagen wir stattdessen vor, die beiden Wendepunkte der axialen Antwort um ihr Maximum herum zu lokalisieren. Dies bietet eine Möglichkeit, aus einem einzelnen Scan zwei axial verschobene Topografien zu berechnen[24], die als Eingangsdaten für die vorgeschlagene Methode verwendet werden können. Dazu differenzieren wir die axiale Antwort und lokalisieren die resultierenden Peaks (siehe Methoden). Ein experimentelles Beispiel ist zur Veranschaulichung in Abb. 7 gezeigt; weitere Einzelheiten finden sich in Supplementary Note 4 und Supplementary Abb. 5.

Die Breite der axialen Antwort und damit auch die axiale Verschiebung zwischen diesen Topografien ist jedoch selbst ohne Nichtlinearitätsfehler möglicherweise nicht über das gesamte Sichtfeld konstant. Dies verletzt die zentrale Annahme, dass ξ(z) nicht von (x, y) abhängt. Tatsächlich führen bereits geringe feldabhängige optische Aberrationen zu einer Variation in der Differenz zwischen dem Topografiepaar. Dies ist im experimentellen Beispiel in Abb. 7 erkennbar. Neben optischen Aberrationen können auch probenbedingte Effekte eine Variation der Breite der axialen Antwort verursachen. Beispielsweise bewirken reflektierende Proben mit ausgeprägten lokalen Neigungen effektiv eine Verringerung der System-NA (da Licht, das unter großem Winkel reflektiert wird, nicht durch die Objektivpupille erfasst wird), wodurch sich die Breite der axialen Antwort verändert. Insgesamt bedeutet dies, dass die vertikale Verschiebung in Gl. 2 nicht als konstant angenommen werden kann, sondern eine spezifische Feldabhängigkeit aufweist. Um dies zu lösen, müssen wir die axiale Verschiebung Δz(x,y) über das Sichtfeld messen oder abschätzen und in den Rekonstruktionsalgorithmus einbeziehen. Eine Beschreibung und weitere Details zur Schätzung von Δz(x,y) aus den Messdaten finden sich unter Methoden.

Wir haben den Stufenhöhenstandard gemessen, um die Selbstkorrektur zu bewerten, und eine Reduktion der Metrik σSH um eine Größenordnung erreicht. Dies weist auf eine starke Unterdrückung der Scannerfehler hin, wie in Abb. 9 dargestellt.

Verwendung mehrerer Beleuchtungen

Wir schlagen vor, mehrere Topografien durch den Einsatz von LED-Beleuchtung mit unterschiedlichen zentralen Wellenlängen zu erhalten[25]. Aufgrund einer kleinen, aber messbaren longitudinalen chromatischen Aberration weist der Fokuspunkt bei verschiedenen Wellenlängen eine leichte Verschiebung auf. Dies kann genutzt werden, um mittels eines einzigen Scans zwei axial verschobene Topografien zu erfassen. Bei jedem Scanschritt wird die Probe durch eine einfache elektronische Steuerung schnell abwechselnd mit verschiedenen LEDs beleuchtet, wodurch die für die Rekonstruktion mehrerer Topografien aus einem einzigen Scan erforderlichen Daten erfasst werden.

Wie beim vorherigen Ansatz weist Δz(x,y) eine Feldabhängigkeit auf, die wir abschätzen und in den Selbstkorrekturalgorithmus einbeziehen müssen. Insbesondere entspricht Δz(x,y) der Differenz in der Ebenheitsabweichung, die durch die Feldkrümmung des Systems für die beiden Beleuchtungs-LEDs verursacht wird. Wir haben blaue und grüne LEDs für die Beleuchtung gewählt, die im optischen Profiler verfügbar sind, mit zentralen Wellenlängen von λ=520nm bzw. λ=455nm. Eine Messung eines Planspiegels, die die Differenz in der Feldkrümmung und das resultierende Δz(x,y) hervorhebt, ist in Abb. 8 dargestellt. Neben der Variation der Fokusebene und der Feldkrümmung kann es Unterschiede in der Vergrößerung geben, die – falls signifikant – Fehler bei der Berechnung der Differenz zwischen den Topografien verursachen könnten. Typische Dimensionsskalen in der mikroskopischen topografischen Bildgebung sind jedoch in lateraler Richtung um ein Vielfaches größer als in axialer Richtung, sodass dies bei gut korrigierten Objektiven nicht signifikant ist. Insbesondere beobachteten wir für das hier verwendete Objektiv eine laterale Verzerrung von unter 0,2 % über das gesamte Sichtfeld, was nur minimale Auswirkungen hat und in Richtung des Zentrums des Sichtfelds praktisch verschwindet.

Die Ergebnisse wiederholter Stufenhöhenmessungen für alle Profile, wie in Abb. 3 beschrieben, sind im Histogramm in Abb. 9 dargestellt. Die Unterdrückung der Nichtlinearitätsfehler verringert die Streuung über die Messungen hinweg, was durch die Metrik σSH quantifiziert wird, die für jeden Fall angegeben ist. Die Ergebnisse für den kommerziellen optischen Profiler sind in Abb. 9 für folgende Fälle dargestellt: unkorrigierte Daten mit dem Linearachsen-Scanner (rot), selbstkorrigiert mittels Differenzierung der axialen Antwort (blau), selbstkorrigiert mittels Mehrfachbeleuchtung (gelb) sowie Messungen mit dem hochwertigen piezoelektrischen Scanner des kommerziellen Instruments als Referenz (grün). In beiden Fällen führt die Selbstkorrektur zu einer deutlichen Reduktion der Nichtlinearitätsfehler und somit zu einer verringerten Metrik σSH. Wie bereits bei den im vorherigen Abschnitt präsentierten Ergebnissen unterdrückt die Selbstkorrektur Nichtlinearitätsfehler, und wir fokussieren uns bei der Bewertung der Linearisierung der Antwortkurve auf die Präzision statt auf die Genauigkeit.

Bisher haben wir die Selbstkorrektur auf Stufenhöhenstandards angewendet, da sie eine einfache Quantifizierung der Verbesserung ermöglichen. In der Praxis ist es jedoch wünschenswert, die Korrektur auf Proben mit beliebiger Oberflächenform anzuwenden. Beispielsweise kann die lokale Oberflächenneigung an jeder Position im Sichtfeld die Form der axialen Antwort und damit die Funktionsweise der Selbstkorrektur beeinflussen. Ein interessantes Beispiel zur weiteren Bewertung der Leistungsfähigkeit des Algorithmus ist die Messung von Kugeln. Der große Messbereich, der für Kugelmessungen erforderlich ist, macht das Auftreten von Nichtlinearitätsfehlern praktisch unvermeidlich. Beispielergebnisse einer Kugelmessung sind in Abb. 10 dargestellt. In diesem Fall wurde Mehrfachbeleuchtung zur computergestützten Selbstkorrektur verwendet. Die rekonstruierte Topografie ist in (a) dargestellt, das gezeigte Profil in (b) für grüne und blaue Beleuchtung, und die Differenz ist in (c) aufgetragen. Wie zu erkennen ist, sind die Differenzen nicht konstant. In diesem Fall entstehen die Variationen nicht nur durch Nichtlinearitätsfehler, sondern auch durch Feldvariationen infolge von Aberrationen. Nach Schätzung des Feldkorrekturterms und Anwendung der Selbstkorrektur erscheinen die Differenzen abgeflacht, wie in (d) bzw. (e) gezeigt. Zusätzlich haben wir von jeder topografischen Rekonstruktion eine bestangepasste Kugel subtrahiert; die Ergebnisse sind in (f) dargestellt. Die Resultate sind nicht perfekt eben, wie zu erwarten, aufgrund der sogenannten Restebenheitsfehler, die mit der Probenform verbunden sind[26,27]. Wir zeigen in (f) jedoch auch die Ergebnisse einer Messung mit dem piezoelektrischen Scanner, und diese stimmen sehr gut überein. Obwohl Nichtlinearitätsfehler im Allgemeinen korrigiert werden, bleibt ein niederordentlicher Restfehler bestehen, der im Zentrum verschwindet, an den Rändern jedoch sichtbar ist; diesen führen wir auf eine unvollständige Schätzung des Feldkorrekturterms zurück. Insgesamt demonstriert dies die Wirksamkeit der Methode zur Korrektur von Nichtlinearitätsfehlern.

3. Methoden

3.1. Topografierekonstruktion

Für die Implementierung mit replizierter Detektion im kundenspezifisch aufgebauten Mikroskop haben wir Fokusvariation mit aktiver Beleuchtung implementiert. Dazu wird durch das Mikroskopobjektiv (Nikon 20/0.45NA) ein Schachbrett-Beleuchtungsmuster auf die Probe projiziert. Wir scannen die Probe mit einer motorisierten Achse (PI miCos, LS-120) und erfassen bei jedem Scanschritt ein Bild. Zur Berechnung der axialen Antwort (a) wenden wir eine Laplace-Filterung auf das erfasste Bild an und (b) anschließend einen Gauß-Glättungsfilter mit σ=3 Pixeln. Die Wiederholung dieser Operationen für jede axiale Ebene (d. h. jedes erfasste Bild) liefert die axiale Antwort für jedes Pixel. Der Laplace-Operator detektiert hochfrequente räumliche Komponenten und insbesondere die scharfen Kanten des projizierten Schachbrettmusters und reagiert dadurch effektiv auf den Fokus, während die Gauß-Glättung anschließend angewendet wird, um die Textur des projizierten Musters zu unterdrücken. Der Wert von σ wird passend zur Größe des Schachbretts gewählt, das klein genug sein sollte, um die laterale Auflösung nicht übermäßig zu beeinträchtigen. Ein Beispiel ist in Abb. 4 (b,c) enthalten und zeigt, wie das Ausgangssignal effektiv den Fokus detektiert: In (c) wird in scharf fokussierten Bereichen, in denen das Schachbrettmuster im Rohbild (b) sichtbar ist, ein höheres Signal erhalten. Das resultierende Signal bildet somit die axiale Antwort für jedes Pixel, die fokussensitiv ist. Zur Lokalisierung des Maximums passen wir eine Gaußkurve an die drei Datenpunkte um das Maximum an. Für die beschriebenen Experimente scannen wir einen Gesamtbereich von 60μm mit einer Schrittweite von 1μm.

Für die mit dem kommerziellen System (S neox, Sensofar) durchgeführten Experimente wurde der konfokale Modus des Systems verwendet, bei dem strukturierte Beleuchtung zur optischen Schnittbildung projiziert wird[28]. Es wurde ein Vollbereichsscan von 60μm mit einer Schrittweite von 0.4μm durchgeführt. Das System ist mit einer motorisierten Achse und einem piezoelektrischen Scanner ausgestattet, wodurch Messungen mit beiden Technologien zum Vergleich möglich sind. Die Experimente wurden mit einem Mikroskopobjektiv 20/0.45NA und der motorisierten Achse durchgeführt, um einen großen Scanbereich zu ermöglichen und die Korrektur von Nichtlinearitätsfehlern zu demonstrieren.

Für die Implementierung, die auf Glättung und Differenzierung der axialen Antwort beruht, haben wir Savitzky-Golay[29]-Filter verwendet, die eine Polynomapproximation an ein Fenster von Datenpunkten anpassen. Der Glättungsfilter passt ein Polynom 3. Ordnung an ein gleitendes Fenster von 2m₂ + 1 Punkten an, wobei m₂ die halbe Fensterbreite ist. In dieser Studie verwendeten wir m₂ = 7, entsprechend einer Gesamtfensterbreite von 15 Punkten. Zur Berechnung der Ableitung bestimmt der Savitzky-Golay-Filter die Steigung des angepassten Polynoms am zentralen Punkt jedes Fensters. Auch für die numerische Ableitung wurde m₂ = 7 verwendet. Weitere Details und Veranschaulichungen finden sich in Supplementary Note 4 und Supplementary Abb. 5.

Abschließend wenden wir auf die rekonstruierten Topografien eine Gauß-Glättung (σ=3) an, um das Rauschen zu reduzieren.

3.2. Iterative Selbstkorrektur

Zunächst berechnen wir die Differenz zwischen den beiden gemessenen Topografien,

wobei wir explizit nur eine Abhängigkeit von z angeben und F(x, y) eine Variation von Δz an verschiedenen (x, y)-Positionen berücksichtigt. Ist Δz in Gl. 2 für alle (x, y) konstant, dann hängt die Differenz nur von ξ(z) ab, ist unabhängig von (x, y) und F(x, y) verschwindet. Hat Δz hingegen eine Abhängigkeit von (x, y), dann ist der Restterm F(x, y) so definiert, dass er diese Abhängigkeit erfasst und über das Sichtfeld hinweg einen Nullmittelwert besitzt. Wie F(x, y) abgeschätzt werden kann, erläutern wir im nächsten Unterabschnitt.

Um die Differenz zwischen den Topografien aus unseren beiden pixelierten topografischen Messungen zu berechnen, unterteilen wir den axialen Messbereich in gleichmäßig verteilte Intervalle mit Zentren bei z_i und berechnen den Mittelwert von Gl. 5 für alle Pixel, die in jedes Intervall fallen. Das heißt,

wobei die Summation in jedem Intervall i über alle Pixel erfolgt, die die Bedingung erfüllen,

wobei Φ(x,y) die korrigierte Topografie ist, 2δz=z_i − z_i−1 die Breite der Intervalle ist und N_i die Anzahl der Pixel im Intervall i. Beachten Sie, dass die abgetasteten Differenzen entsprechend der korrigierten Topografie Φ(x,y) in Intervalle eingeordnet werden, die anfangs unbekannt ist, aber geschätzt werden kann, wenn wir eine Schätzung von ξ(z) haben, durch Invertierung von Gl. 1.

Wir formulieren das Problem als iterativen Prozess. In Iteration n berechnen wir die korrigierten Topografien mit der aktuellen Schätzung der Antwortkurve ξ_n(z) als,

wobei die Antwortkurve als Identitätsfunktion initialisiert wird, also ξ₀(z)=z.

Wir verwenden Φ_n(x,y) in der Bedingung (7), um unsere Schätzung von ΔΦ_meas(z) mithilfe von Gl. 6 zu aktualisieren, die wir mit ΔΦ_n(z) bezeichnen. Die Antwortkurve für die nächste Iteration erhält man durch Integration,

Die Gleichungen (8) und (9) liefern Φ(x,y) gegeben ξ(z), und die Gleichungen (6), (7) und (10) liefern ξ(z) gegeben Φ(x,y); diese können daher bis zur Konvergenz iteriert werden. Konvergiert ξ_n(z) zur wahren Antwortkurve ξ(z), dann konvergieren die Differenzen ΔΦ_n(z) für alle (x, y) gegen Δz. Mit anderen Worten: Die Differenz zwischen korrigierten Topografien wird flach. In diesem Zustand wurden die Nichtlinearitätsfehler erfolgreich korrigiert.

In den nächsten Unterabschnitten beschreiben wir die numerische Integration und den Binning-Prozess. Einen Überblick über den vollständigen Algorithmus bietet Algorithmus 1 in den Supplementary Information.

3.3. Abschätzung der Antwortkurve aus differentiellen Messungen

Um ξ(z) aus einer gegebenen Menge von Werten ΔΦ_i zu berechnen, führen wir eine numerische Integration von Gl. 10 durch. Da Δz in der Praxis jedoch nicht beliebig klein sein kann, ist dabei gewisse numerische Sorgfalt erforderlich. Wir führen die Integration durch, indem wir die abgetastete Antwortkurve ξ(z_i) bei zunehmenden Werten z_i aufbauen. Dies sind dieselben Positionen, die zur Abtastung von ΔΦ_i in Gl. 6 verwendet werden. Beginnend mit dem niedrigsten Wert z₀ und in Bottom-up-Richtung berechnen wir aufeinanderfolgende Stichproben der Antwortkurve als,

wobei der Wert ξ_ini(z_i – Δz) linear mit ξ_ini(z_j) und ξ_ini(z_j+1) interpoliert wird, wobei z_j der höchste Wert ist, der die Bedingung z_j < z_i – Δz erfüllt. Dieser Bottom-up-Ansatz ist in Abb. 11 dargestellt.

Die lineare Extrapolation, die für die Anfangspunkte z_i < z₀ + Δz verwendet wird, kann jedoch eine Abweichung von der tatsächlichen Antwortkurve hinzufügen, die in die nachfolgenden Berechnungen übernommen wird. Glücklicherweise wird diese Abweichung zunehmend abgeschwächt, je weiter wir ξ(z_i) für steigende z_i berechnen. Um dieses Problem zu lösen, wiederholen wir den Vorgang ausgehend vom höchsten z_i und berechnen ξ(z_i) für sukzessive abnehmende z_i als,

wobei z_last der höchste Wert von z_i ist und ξ_ini nur im höchsten z-Bereich verwendet wird, wo die Abweichung maximal unterdrückt ist.

3.4. Abschätzung der Feldvariation des axialen Abstands

Wie erwähnt, muss unser Selbstkorrekturalgorithmus möglicherweise mit Eingangstopografien angewendet werden, deren axialer Versatz über das Sichtfeld variiert, Δz(x,y). Es ist zwingend erforderlich, diese Abhängigkeit in Gl. 3 zu berücksichtigen, bevor versucht wird, die Antwortkurve ξ(z) durch numerische Integration zu bestimmen. Leider kann sie nicht im Voraus kalibriert werden, da die Eigenschaften der Probe selbst die Form dieser Feldvariation beeinflussen.

Um Δz(x,y) zu berücksichtigen, fügen wir in Gl. 5 den Feldkorrekturterm F(x, y) hinzu. Zur Berechnung von F(x, y) bestimmen wir ΔΦ_meas(z) mittels des in Gl. 6 beschriebenen Binning-Prozesses und definieren zusätzlich ein Disparitätsmaß, das die Standardabweichung der Werte innerhalb jedes Intervalls berechnet als,

Interessanterweise werden die Werte innerhalb jedes Intervalls unähnlicher, wenn F(x,y) die Abhängigkeit von (x, y) nicht angemessen erfasst, wodurch die Werte S_i steigen. Eine gute Schätzung von F(x, y) sollte daher S_i minimieren, wie in Supplementary Abb. 7 gezeigt. Gleichzeitig erwarten wir, dass F(x, y) eine glatte Variation aufweist. Um dies zu erfüllen und Überanpassung zu vermeiden, definieren wir F(x, y) als,

wobei Zⁿ_m Zernike-Polynome sind.
​
Die Koeffizienten α^m_n bestimmen wir durch Minimierung von Gl. 13 und entkoppeln so effektiv die Abhängigkeit von (x, y) von z (weitere Details siehe Supplementary Note 7). Das heißt,

Die Berechnung der Werte S_i und damit auch der resultierenden Werte α^m_n hängt prinzipiell von der Binning-Bedingung (7) ab, sodass der Prozess eigentlich in das Hauptiterationsverfahren einbezogen werden müsste. In der Praxis ist die Berechnung von F(x, y) jedoch robust, und es genügt, die Schätzung aus der ersten Iteration zu verwenden. Dies reduziert die Rechenlast, da die Minimierung in Gl. 15 rechenintensiv ist.

In unseren experimentellen Implementierungen haben wir festgestellt, dass die Verwendung von Zernike-Polynomen bis zur Ordnung n=2 zufriedenstellende Ergebnisse liefert. Das bedeutet, dass – bei Vernachlässigung des Pistonterms α⁰₀ – die Feldabhängigkeit F(x, y) vollständig durch 5 Parameter α^m_n beschrieben wird. Weitere Informationen sowie eine visuelle Darstellung der Abschätzung des Feldkorrekturterms und der ausgewählten Zernike-Polynome finden sich in Supplementary Figures 7 und 8.

4. Diskussion

Wir haben einen Selbstkorrekturalgorithmus entwickelt, der Nichtlinearitätsfehler im Scanmechanismus der 3D-Mikroskopie deutlich reduzieren kann. Der Ansatz ist insofern rechnerisch selbstkorrigierend, als diese Fehler aus denselben Daten berechnet werden, die auch für die 3D-Rekonstruktion verwendet werden. Die Technik kann ohne Hardwaremodifikationen und ohne Kompromisse in bestehende Geräte implementiert werden.

Natürlich kann die Technik Nichtlinearitätsfehler nur in den Bereichen selbstkorrigieren, in denen Daten zur Korrektur vorhanden sind. Das heißt, sie kann nur die axialen Bereiche korrigieren, die für bestimmte Positionen im Sichtfeld von der Probe eingenommen werden. Prinzipiell ist dies keine Einschränkung, da Fehler außerhalb des von der Probe eingenommenen Messbereichs in der Praxis irrelevant sind. Wenn die Probe jedoch Lücken in ihrem kontinuierlichen Höhenverlauf aufweist, können Fehler in diesen Lückenbereichen nicht berechnet werden, und die relative Höhe zwischen höhenmäßig getrennten Bereichen bleibt weiterhin von verbleibenden Nichtlinearitätsfehlern in der Lücke beeinflusst. Mit anderen Worten: Die Technik setzt voraus, dass das Histogramm der Probenhöhen im interessierenden Bereich kontinuierlich gefüllt ist. Ist dies nicht der Fall und enthält das Höhenhistogramm der Probe Lücken, können Nichtlinearitätsfehler in diesen Bereichen nicht geschätzt werden. Dies ist beispielsweise bei der Messung von Stufenhöhenstandards der Fall, deren Histogramm aus zwei Peaks besteht. Dieses Problem kann jedoch durch Verkippung der Probe gelöst werden, wie wir es in unseren Experimenten getan haben. Ist dies nicht möglich, kann die Methode dennoch angewendet werden; die Antwortkurve für diese Bereiche würde dann jedoch interpoliert, um die Lücken zu füllen.

Ziel der vorgeschlagenen Methode ist es, die Antwortkurve des Instruments zu linearisieren, und wir haben eine deutliche Reduktion der Nichtlinearitätsfehler gezeigt. Die Methode kann jedoch nicht den Verstärkungsfaktor, d. h. die Steigung der Antwortkurve, messen und korrigieren. Der Verstärkungsfaktor wird typischerweise durch Messung eines zertifizierten Standards kalibriert, und unsere Methode geht davon aus, dass die Antwortkurve lokal von der linearen Form abweicht, ansonsten aber einen Verstärkungsfaktor besitzt, der kalibriert werden kann. Dies hängt eng mit der Wahl des axialen Offsets Δz zusammen, der bei der Rekonstruktion verwendet wird. Größere oder kleinere Werte als der tatsächlich realisierte Offset würden den resultierenden Verstärkungsfaktor der geschätzten Antwortkurve direkt verändern. Da das Ziel der Methode die Linearisierung der Antwortkurve ist, konzentriert sich die Diskussion der hier vorgestellten Ergebnisse auf die Präzision statt auf die Genauigkeit; bewertet wird dies hier als Streuung über wiederholte Messungen.

Der axiale Offset Δz wird verwendet, um die differentielle Messung durchzuführen und die Ableitung der axialen Antwort abzuschätzen. Da dieser Abstand nicht infinitesimal klein ist, beschränkt er die Berechnung auf langsame Änderungen der Steigung, was vorteilhaft ist, da die Modulationen der Nichtlinearitätsfehler mit größerer Amplitude typischerweise eine niedrigere Frequenz aufweisen.

Wir haben die Methode mit drei Ansätzen zur Gewinnung des erforderlichen Topografiepaars demonstriert: (a) mittels replizierter Detektion, (b) durch Differenzierung der axialen Antwort und (c) durch Mehrfachbeleuchtung. Die erste Methode bietet den Vorteil, dass der axiale Offset zwischen dem Topografiepaar fest ist (d. h. nicht von Probenform, Material, Neigung usw. abhängt), erfordert jedoch modifizierte Hardware mit zwei Kameras und einem Strahlteiler. Obwohl ein Kalibrierschritt erforderlich ist, um eine Zuordnung zwischen den lokalen Koordinaten der beiden Kameras zu erstellen, ist dies nicht kompliziert und führt zu einer robusten Implementierung. Die zweite Implementierung, die auf der Differenzierung der axialen Antwort basiert, hat den Vorteil, dass keinerlei Modifikation erforderlich ist; sie kann direkt angewendet werden, um topografische Messungen aus dem üblicherweise erfassten Datensatz zu verbessern. Wir haben jedoch beobachtet, dass für robuste Ergebnisse eine dichtere axiale Abtastung empfehlenswert ist, da wir sonst periodische Artefakte in den rekonstruierten Topografien beobachtet haben (siehe Supplementary Note 5). Aus diesem Grund haben wir die axiale Antwort beim 20X/0.45NA-Objektiv mit einer Schrittweite von 0.4μm abgetastet, was zu einer höheren Anzahl erfasster Bilder führt (das für die Experimente verwendete kommerzielle System nutzt für dieses Objektiv eine Schrittweite von 1μm). Schließlich erfordert der Ansatz der Mehrfachbeleuchtung naturgemäß die Erfassung von zwei Bildern pro Schritt. Darüber hinaus ist es prinzipiell nicht garantiert, dass eine kleine longitudinale chromatische Aberration für zwei verschiedene Farbbänder einen nutzbaren axialen Offset erzeugt, da dies von der tatsächlichen optischen Leistung des Mikroskopobjektivs abhängt – wenngleich dies, wie hier gezeigt, sehr wahrscheinlich ist. Insgesamt erscheint der Mehrfachbeleuchtungsansatz unter verschiedenen Bedingungen und insbesondere zur Berechnung des Feldkorrekturterms robuster. Wenn beispielsweise die Form der axialen Antwort durch die Probe beeinflusst wird (etwa durch Form, Material oder Neigung), kann die Lokalisierung der Peaks für zwei Wellenlängen robuster sein als eine Messung, die auf der Bestimmung der Breite einer einzelnen axialen Antwort beruht.

5. Datenverfügbarkeit

Die in der vorliegenden Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim korrespondierenden Autor erhältlich.

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